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高通量基因测序及生物信息分析技术平台

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    高通量测序技术是对传统测序的一次革命性改变,能够一次对几十万到十数亿条DNA分子进行序列测定,因此在有些文献中称其为下一代测序 技术(next generation sequencing)。高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能,所以又被称为深度测序(deep sequencing)。高通量测序技术的应用让疾病诊断更加具体科学,也为疾病治疗提供新的解决办法。
    我中心的高通量测序平台使用的是美国Illumina公司的HiSeq 2000测序仪,是一种基于单分子簇的边合成边测序技术,它基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面(即 Flow cell),这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后,在Flow cell上形成了数以亿计Cluster,每个Cluster是具有数千份相同模板的单分子簇。然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸,通过可逆性 终止的SBS(边合成边测序)技术对待测的模板DNA进行测序。

 仪器设备

► Illumina HiSeq 2000测序仪              ► Agilent 2100生物分析仪
 
► Invitrogen Qubit 荧光计                      ► ABI 9700 PCR扩增仪

 

 开展项目

 新物种全基因组测序(De novo测序)

       De novo测序即全基因组从头测序,是指不依赖于任何已知基因组序列信息对某个物种的基因组进行测序,然后应用生物信息学手段对测序序列进行拼接和组装,获 得该物种基因组序列图谱,同时借助比较基因组方法来探索生物的起源和进化。通过de novo 测序获得一个物种的全基因组序列是快速了解该物种的一个重要途径。
Illumina HiSeq 2000测序通量高,可为基因组组装提供高覆盖率的数据大大降低了基因组测序成本缩短了测序时间,因此也给基因组学研究带来了新的发展契机和革命性突破。 利用高通量测序技术以及强大的生物信息分析能力,可以高效、低成本地测定并分析所有生物的基因组序列。
对于细菌、真菌等基因组测序,Illumina HiSeq 2000的 Paired-End测序使得基因组测序成本及基因组组装难度均大大降低,缩短了测序时间,比传统测序法得到更高精度和覆盖倍数的基因组精细图,生物信息学分析也更加完善。

        全基因组重测序(Re-seq)全基因组重测序是对基因组序列已知的不同个体进行全基因组测序,并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。它可以获取最 全的基因组信息,找到大量的单核苷酸多态性位点(SNP),插入缺失位点(InDel,Inser/Deletion)、杂合性缺失(LOH)、拷贝数变 异(CNV)以及基因组重排导致的结构变异位点(SV,Structure Variation),更为全面地挖掘基因序列差异和结构变异,实现基因型多样性分析、遗传进化分析以及致病和易感性基因等的筛选。随着高通量测序技术的 发展与普及,全基因组重测序已成为疾病研究、人类遗传和群体进化研究领域最为有效的方法。

基因组目标区域重测序(Targeted-resequencing)

        基因组目标区域重测序是指对感兴趣的特定基因组DNA区域进行高通量测序。主要流程为首先针对感兴趣基因组区域设计特异性的寡核苷酸探针,然后通过将基因 组DNA文库与液相探针杂交富集目标区域再进行高通量测序。目标区域重测序主要优势在于可针对特定区域进行测序有效降低了测序成本提高了测序深度,能够更 经济有效精确地发现特定区域遗传变异的信息。可用于寻找复杂疾病的致病基因和易感基因等的研究。

 全外显子组测序(exome-seq)

        全外显子组测序是利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕获并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。由于其具有对常见和罕见变异高灵敏度,能发现 外显子区绝大部分疾病相关变异以及仅需要对约1%的基因组进行测序等优点,促使全外显子组测序成为鉴定孟德尔疾病的致病基因最有效的策略,也被运用于复杂 疾病易感基因的研究和临床诊断中。

染色质免疫共沉淀测序(ChIP-seq)

       染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)也称结合位点分析法,是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具,通常用于转录因子结合位点或组蛋 白特异性修饰位点的研究。将ChIP与高通量测序技术相结合的ChIP-Seq技术,能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA区 段。

转录组测序(RNA-Seq)

        转录组测序的研究对象为特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和,包括mRNA和非编码RNA。转录组研究是基因功能及结构研究的基础和出发点,通过新一代高通量测序,能够全面快速地获得某一物种特定组织或器官在某一状态下的几乎所有转录本序列信息。
高通量转录组测序技术,无需了解物种基因信息,能够对任意物种进行转录组分析,并且测定每个转录本的片段序列,能够同时鉴定和定量稀有转录本和正常转录 本,以及检测基因家族中相似基因和可变剪接造成的不同转录本的表达,被广泛的应用于转录本结构研究(基因边界鉴定、可变剪切研究等),转录本变异研究(如 基因融合、编码区SNP研究),基因表达水平研究以及全新转录本发现。

Small RNA测序

        Small RNA是一类长度在20~30nt的RNA分子,主要包括miRNA、siRNA和piRNA。Small RNA能够调控基因的表达,在细胞的生长、发育、代谢等基础生物学过程中扮演着重要的角色,甚至在癌症等相关疾病形成过程中起着关键的作用。第二代高通量 测序技术省去了烦琐的Small RNA克隆文库构建过程,能够快速鉴定特定条件下的表达的已知Small RNA并发现新的Small RNA,同时还可以研究不同条件下Small RNA的表达差异。